多巴胺作為最為重要的神經遞質之一，在生物體調控獎賞、成癮、學習記憶以及運動等生理功能中發揮著至關重要的作用。多巴胺系統的失調與帕金森、精神分裂癥等多種精神疾病密切相關。對多巴胺高時空分辨率、高靈敏特異的檢測對于進一步理解其在各種生理和病理條件下的作用，具有十分重要的意義。李毓龍實驗室在2018年報道了第一代的綠色多巴胺探針DA1m和DA1h（Fangmiao Sun et al., Cell, 2018），并于2020年發表了第二代的綠色多巴胺探針DA2m和DA2h和紅色多巴胺探針rDA1m和rDA1h（Fangmiao Sun et al., Nature Methods, 2020）。雖然這些探針已能滿足對于多巴胺神經元密集投射的腦區（如紋狀體和伏隔核）內多巴胺的靈敏檢測，但對于投射稀疏的前額葉皮層、杏仁核等腦區內多巴胺的檢測卻十分困難。此外，第一代紅色多巴胺探針整體的反應幅度、靈敏度以及特異性都有待進一步提升。

2023年12月1日，北京大學李毓龍實驗室在Nature Methods雜志在線發表了題為Improved green and red GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo的研究論文，成功開發了第三代的紅綠雙色多巴胺探針工具包，并通過在體紅綠雙色成像等方式證明全新一代多巴胺探針在多腦區、多行為范式下均能靈敏特異地檢測多巴胺及其它信號分子的時空動態釋放。

李毓龍團隊基于GRAB探針策略 (GPCR-Activation Based Sensor)，已先后開發了針對膽堿類、單胺類、嘌呤類、脂類和神經肽類神經遞質/調質的熒光探針。近日，該團隊發表在Science上報道了一種全新、高效、通用的熒光報告模塊嫁接策略，并開發出了一系列神經肽熒光探針（Huan Wang et al., Science, 2023）。在本研究中，研究人員基于相似策略，將含有熒光報告基團模塊的ICL3從現有的神經遞質探針中移植到多種不同物種的多巴胺受體中，從而開發出了一系列全新一代多巴胺探針，包括綠色第三代多巴胺探針gDA3m, gDA3h及紅色第二代多巴胺探針rDA2m, rDA2h, rDA3m和rDA3h。

圖1：新一代雙色多巴胺探針的開發和細胞刻畫。

作者首先在哺乳動物細胞和原代培養神經元內對這一系列多巴胺探針的性能進行刻畫比較，發現全新一代紅綠多巴胺探針無論在反應幅度、靈敏度和選擇性上都顯著優于現有的多巴胺探針。在急性腦片電刺激實驗中，gDA3m和rDA3m探針不僅可靠報告了多巴胺釋放的動態變化，還忠實保留了受體骨架本身的藥理學特性。在體的光遺傳學激活實驗也發現這一系列全新多巴胺探針能靈敏、特異地刻畫多巴胺的動態釋放。

圖2：光纖記錄小鼠在交配行為中伏隔核腦區多巴胺和cAMP的動態變化。

為進一步確認新一代紅色多巴胺探針的在體檢測能力，作者將rDA3m和綠色cAMP探針GFlamp1共表達在小鼠伏隔核腦區，并用光纖記錄探測多巴胺以及下游神經元胞內信號分子cAMP在雄鼠交配行為過程中不同階段的動態信號變化，發現了多巴胺及其下游信號cAMP動態變化的一致性。此外，作者將rDA3m和乙酰膽堿探針ACh3.0共表達在小鼠的前額葉皮層和伏隔核，并利用光纖記錄的方式記錄在巴普洛夫條件學習中，小鼠在獎賞和厭惡刺激條件下兩個腦區兩種神經遞質在不同訓練時期的動態變化。通過雙光子成像實驗，作者進一步精確觀測到在跑步、尾部電刺激和聲音刺激等不同條件下M1/M2皮層中gDA3h的時空動態變化。

圖3：光纖記錄小鼠在巴普洛夫條件學習過程中前額葉皮層和伏隔核腦區多巴胺及乙酰膽堿的動態變化。

綜上所述，此研究利用新型ICL3嫁接策略，成功構建了全新一代的紅綠雙色多巴胺探針工具包。與已發表的多巴胺探針相比，全新一代多巴胺雙色探針具有更高的反應幅度、更好的靈敏度和更特異的選擇性，使得在體雙色光纖記錄多種神經遞質分子在多個腦區不同行為下的動態變化及皮層雙光子成像成為可能。因此，此研究開發的全新一代多巴胺探針彌補了現有多巴胺探針的短板，對于中樞神經系統不同腦區的多巴胺都能實現靈敏、特異的檢測，為進一步深入研究多巴胺系統在生理和病理條件下的作用和分子機理提供了更為強大的工具。

圖4：雙光子成像小鼠皮層在強迫運動條件下多巴胺釋放的時空動態變化。

北京大學生命科學學院李毓龍教授為該論文的通訊作者；北京大學生命科學學院博士生卓一洲、博士后羅斌為該論文的共同第一作者；北京大學已畢業本科生易馨陽，北京大學副研究員董輝、趙玉琳，北京朝陽醫院苗曉蕾，北京大學博士后萬金霞，博士研究生蔡儒儀、王蕾、王歡和鄭宇等為該論文做出了重要貢獻。該工作得到了哈佛大學的Mitsuko Watabe-Uchida實驗室，中國科學院深圳先進技術研究院的朱英杰實驗室，俄勒岡健康科學大學的John T. Williams 實驗室和Marina E. Wolf實驗室的通力合作；國家自然科學基金、國家重點研發計劃、北京市科委、北京大學膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心、深港腦科學創新研究院、峰基金、新基石科學基金會所設立的新基石研究員項目與科學探索獎等機構和經費的大力資助和支持。

李毓龍實驗室更多相關工作詳見：http://yulonglilab.org/。李毓龍實驗室長期誠聘不同學科背景的副研究員、博士后及技術員，待遇從優。歡迎對腦科學感興趣的有志青年加入！

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-023-02100-w

專家點評

胡海嵐（浙江大學教授，神經科學中心執行主任，腦科學與腦醫學學院院長）

多巴胺能系統廣泛分布在神經系統，通過中腦-邊緣-皮質通路和黑質紋狀體通路兩條信號通路對強化學習、獎賞行為、認知和工作記憶等生理過程發揮著至關重要的作用。研究多巴胺的信號作用機制離不開合適的工具。近年來，李毓龍課題組和Lin Tian課題組基于G蛋白偶聯受體激活原理率先開發出初代綠色和紅色多巴胺熒光探針，實現了對多巴胺在體動態的實時檢測。然而，受限于這些探針較低的信噪比和檢測靈敏度，我們仍然無法直接對低濃度下多巴胺動態變化進行靈敏且可靠的檢測，特別是研究在體情況下多巴胺投射密度較低的腦區中多巴胺的動態和行為關系。在這項新研究中，李毓龍課題組開發了新一代具有更高靈敏度、更高信噪比、更高特異性以及兼具不同親和力和藥理學特性的綠色和紅色多巴胺熒光探針。在活體小鼠中，這些探針不僅可以檢測到接收密集多巴胺能投射的伏隔核腦區的穩定多巴胺信號，還能在接收稀疏多巴胺能投射的大腦皮層和杏仁核腦區中靈敏觀察到多巴胺的動態變化。
得益于該系列探針在多巴胺監測方面顯著提高的靈敏度和信噪比，這項研究隨后揭示了強化學習行為下中腦-邊緣-皮質通路中存在腦區特異的多巴胺釋放特征。此外，通過將最新的紅色多巴胺探針與其它綠色熒光探針聯用，并且結合雙色記錄技術實時監測多巴胺和其余信號分子，李毓龍課題組進一步揭示了活體小鼠在體行為模式下多腦區中多巴胺和多種神經化學信號（包括內源大麻素、乙酰膽堿和胞內第二信使環磷酸腺苷）的動態關聯。這一系列新型多巴胺熒光探針為今后深入解析多巴胺能系統在體內的功能開辟了全新的途徑。

王佐仁（中國科學院大學教授，中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心高級研究員）

李毓龍團隊最近又成功開發了一系列高靈敏度、高特異性、具有亞秒級響應動力學并能檢測寬濃度范圍的多巴胺分子探針。這是李毓龍團隊堅持本土化原始創新的最新成果，為神經科學研究者解析大腦內密集和稀疏內布的多巴胺釋放的時空動態提供了最新工具。這些新工具將在研究多巴胺這一重要神經遞質的投射網絡如何調控生理和病理過程的工作中發揮重要作用， 有望為理解大腦工作原理和研發相關神經疾病的早期診治新策略作出重大貢獻。