人體中有上百種神經肽，它們在調節新陳代謝、疼痛感知、睡眠與晝夜節律、情緒和學習等多種生理功能中發揮著重要作用。神經肽信號傳導的異常與許多疾病有關，如失眠、糖尿病和抑郁癥。為了深入了解神經肽在生理條件和疾病中的功能，開發具有高時空分辨率的神經肽檢測技術至關重要。此外，建立一個兼具高效和普適性的神經肽探針開發平臺，可以極大地助力更多神經肽探針的開發。

2023年11月17日，北京大學李毓龍實驗室在Science雜志在線發表了題為A tool kit of highly selective and sensitive genetically encoded neuropeptide sensors的研究論文報道了一種通過在神經肽受體中嫁接由熒光報告模塊和部分第三胞內環（Intracelllular loop 3, ICL3）形成嵌合體的探針開發策略，高效可通用地開發了一系列神經肽熒光探針工具包。由此策略開發而出的SST和CRF探針可以實現在細胞、組織和小鼠在體腦成像中以高靈敏度、高特異性對神經肽的濃度變化進行實時監測。

此前，李毓龍團隊利用基于G蛋白偶聯受體激活的探針開發策略先后開發了針對膽堿類、單胺類、嘌呤類和脂類神經遞質/調質的熒光探針。在此項研究中，研究人員將含有熒光報告模塊的ICL3從一種現有的神經遞質探針中移植到神經肽的GPCR中。由此形成的新型嵌合體蛋白在與神經肽結合后可以發生熒光變化，從而報告神經肽濃度的動態變化。利用這種策略，研究人員開發了一系列神經肽的熒光探針，包括生長抑素（somatostatin, SST）、促腎上腺皮質激素釋放因子（corticotropin-releasing factor, CRF）、膽囊收縮素（cholecystokinin, CCK）、神經肽Y（neuropeptide Y, NPY）、神經緊張素（neurotensin, NTS）和血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）。

圖1：基于通用型ICL3移植策略開發神經肽類GRAB探針。

研究人員發現，去甲腎上腺素（NE）探針GRAB_NE的ICL3具有較好的移植適配性，通過將GRAB_NE的ICL3替換移植到神經肽GPCR中，經過進一步優化后即開發出了對應的神經肽GRAB探針。這些神經肽探針能夠以納摩級靈敏度檢測特定的神經肽。此外，研究人員發現，探針的表達并不會對神經元活動、細胞轉錄組和動物行為產生顯著影響。

圖2：體外刻畫SST1.0和CRF1.0探針特性。

該研究進一步詳細展示了SST和CRF探針的應用價值。具體而言，研究人員使用SST1.0探針成功檢測到體外培養的大鼠皮層神經元和小鼠離體胰島中內源的SST釋放，并揭示了小鼠在條件學習過程中基底外側杏仁核（basal lateral amygdala, BLA）腦區的SST動態變化。此外，研究人員將CRF1.0探針表達在小鼠的中央杏仁核（central amygdala, CeA）腦區，CRF1.0探針可靠地報告了小鼠急性腦切片中電刺激引發的CRF釋放。研究人員通過光纖記錄技術檢測到活體小鼠的下丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)在應激刺激時CRF水平的變化。研究人員進一步運用雙光子成像的方式，在應激刺激下觀測到小鼠運動皮層和前額葉皮質中CRF的時空動態變化。

圖3： 光纖記錄小鼠在條件學習過程中BLA腦區的SST動態變化。

綜上所述，此研究報道了一種基于“ICL3嫁接”的高效開發神經肽熒光探針的策略。利用此策略，研究人員開發了一系列GRAB探針用于實時監測神經肽的動態變化（包括CRF、SST、CCK、NTS、NPY和VIP），并展示了一系列應用成果，證明GRAB SST1.0和CRF1.0探針能夠以高靈敏度、特異性和時空分辨率在體外和體內監測神經肽的動態變化。這種靈活的探針開發策略和利用此策略開發出的多種神經肽熒光探針為研究神經肽在生理和病理狀態下的釋放、調控和功能提供了重要工具。

圖4： 雙光子成像小鼠皮層中應激刺激引發的CRF釋放。

北京大學生命科學學院李毓龍教授為本文通訊作者；北京大學生命科學學院博士后王歡、博士畢業生錢統瑞為本論文的共同第一作者；北京大學副研究員趙玉琳、博士研究生卓一洲、耿嵐、傅升韙、鄢羽岐、王蕾等對文章做出了貢獻。該工作得到了中國科學技術大學的周江寧實驗室，美國紐約大學的Dayu Lin實驗室，中國科學院深圳先進技術研究院的朱英杰實驗室，北京大學的湯超實驗室、陳良怡實驗室，以及華中科技大學的江漫實驗室的通力合作。本工作得到了國家自然科學基金、國家重點研發計劃、北京市科委、北京大學膜生物學國家重點實驗室、北大-清華生命科學聯合中心、深港腦科學創新研究院、峰基金、新基石科學基金會所設立的新基石研究員項目與科學探索獎等機構和經費的資助和大力支持。

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原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq8173

專家點評：

徐天樂 上海交通大學特聘教授

神經肽通過與其受體（GPCR）結合，進而調控神經信號的強弱，因此在神經系統中發揮至關重要的作用。 神經肽的合成和釋放具有動態性和時空特異性，目前神經科學家對于神經肽的表達和功能鑒定大多局限于生物化學檢測和藥理學干預，因此生理條件下以足夠的靈敏度和時空分辨率監測神經肽的生物活性是極其必要解決的難題。在這個關鍵問題上，李毓龍課題組的最新研究為我們帶來了希望。通過將熒光報告模塊嫁接到神經肽受體中，李毓龍課題組成功開發了一系列神經肽熒光探針，實現了對特定神經肽生物活性的實時、在體地高效檢測。這些探針在表達后對神經元興奮性、細胞轉錄組和動物行為學表型并無顯著影響，確保其研究結果的可靠性和準確性。李毓龍課題組通過一系列在體以及離體實驗證明了他們開發的探針的有效性和潛在應用價值。通過監測活體小鼠大腦中內源釋放的CRF和SST神經肽的動態變化，為我們深入了解神經肽的生理功能及與疾病的關系提供了重要的工具。通過這些探針的研發，我們能夠直觀地觀察神經肽的存在和活性變化，這為我們揭示神秘的神經肽信號提供了一件利器。